Vesicle permeabilization by fibrils

Det 29-aminosyre lange amfipatiske peptid hormon glukagon (sekvens HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFV QWLMNT) frigives i Langerhans øerne, og har som biologisk rolle at stimulere nedbrydningen af glykogen til glukose via dannelsen af cyklisk AMP. Dette sker når glukagon binder til den 485-aa store glucagon receptor. Peptidet er aktivt som en (fortrinsvist ustruktureret) monomer, men kan ved høje koncentrationer (og relativt højt pH) danne trimerer med mindst 50%     a -helix struktur. På grund af dens amfipatiske struktur, kan den også associere til uopløselige højere-ordens strukturer som geler og fibriller. Vi studerer p.t. glukagon?s fibrillering som et ph.d. projekt, hvorigennem vi har vist at der dannes forskellige fibril-typer under forskellige forhold, som dog alle har en karakteristisk kinetisk opbygning med en latens fase efterfulgt af en relativ hurtig fibrilopbygning. Fibrilstrukturerne har været undersøgt med Atomic Force Microscopy og elektron mikroskopi, og viser sig at have en simpel regelmæssig struktur, bestående af to individuelle fibriltråde (tykkelse 3 nm) snoet om hinanden med en periodicitet på 40-50 nm. Vi har også tegn på at glukagon tidligt i fibrilleringsstadiet danner nogle mindre oligomere strukturer som givetvis er forstadier til fibriller. Der er stigende konsensus om at det er disse oligomerer, snarere end de modne strukturer, der er toksiske overfor celler i kraft af deres evne til at danne porer i cellemembranen. Glukagon fibrillerer ikke i kroppen, men det er tidligere vist at den i monomer form har en evne til at vekselvirke med lipider og detergenter i kraft af dens amfipatiske karakter, hvorved den får overvejende             a -helix struktur med visse uregelmæssige træk. Den kan også danne vandopløselige lipoprotein komplekser med lipider. I en vesikel-bundne tilstand er monomert glukagon formodentlig orienteret parallelt med membranplanen snarere end vinkelret på den. Der er dog ikke nogle rapporter om hvordan glukagon fibriller og oligomerer vekselvirker med forskellige vesikler.     Projektet går ud på at undersøge glukagon?s evne til at perforere syntetiske membraner når den befinder sig i forskellige oligomere former. Assayet vil være baseret på et af flere forskellige membran-permeabiliseringsassays. Alle er baseret på fluorescens-ændringer når stofferne lækker ud af vesiklerne. Som udgangspunkt vil glukagon fibrilleres under standardbetingelser og derefter overføres til de fremstillede membraner ved forskellige tidspunkter for at finde ud af ved hvilket fibrilleringsstadie en evt. lækage finder sted.       Mads Davidsen