Proteome analysis of potato juice and tuber vacuoles from cv. Kuras

 

Mark-dyrkede kartoffelknolde af sorten Kuras blev brugt som model for stivelseskartofler til karakterisering af de opløselige proteiner i kartoffelsaften vha. proteinidentifikation, samt enzym- og proteaseinhiberende aktiviteter. Den største mængde protein i kartoffelknolde udgøres af superfamilierne patatiner (25 %), Kunitz proteaseinhibitorer (KPI, 30 %) og lipoxygenaser (10 %). Den store mængde af lipoxygenase indikerer, at lipoxygenase også fungerer som lagringsprotein. Kartoflens tetraploide natur giver ophav til et meget komplekst proteom. Dette er illustreret ved superfamilien af Kunitz proteaseinhibitorer, hvor der blev fundet 7 familier med ialt 21 isoformer i Kuras. Perspektivet i dette projekt er et øget kendskab til proteinindholdet i kartoffelsaft, som grundlag for fremtidige kommercielle produkter.

  Planteceller indeholder flere typer af vakuoler med specialiserede funktioner. De biologiske funktioner af disse organeller er kendte på det morfologe niveau, men mekanismerne, der transporterer proteiner til vakuolen, er stort set ukendte. For nylig er der blevet stillet spørgsmål ved modellen "en vakuole-type, en transportvej" (Robinson et al., 2005; Vitale og Hinz, 2005), og det er efterhånden klart, at der er adskillige ubesvarede spørgsmål i undersøgelserne af de vakuolære transportveje.

  I dette studie er der blevet brugt flere komplementære metoder til at identificere højt og lavt udtrykte proteiner fra vakuoler oprenset fra kartoffelknolde. En omfattende undersøgelse, af det vakuolære proteom fra kartoffelknolden og en detaljeret analyse af identificerede proteiner og deres mulige vakuolære funktioner, blev udført. Den første forudsætning, for en proteomanalyse på organelniveau, er en høj oprensningsgrad og renhed af den isolerede organel-type. Ved brug af en husholdnings mini-hakker blev der udviklet en metode til oprensning af intakte vakuoler fra mark-dyrkede kartofler. Proteom-analyse af de oprensede vakuoler blev udført ved at fraktionere de opløselige native proteiner i ni fraktioner ved gelfiltrering med Superdex 200. Hver fraktion blev analyseret på to måder: med SDS-PAGE og identifikation ved hjælp af "fingeraftryk" af tryptiske peptiders præcise masser, og tryptisk fordøjelse af de reducerede og carboxymethylerede proteiner i opløsning. Peptiderne blev analyseret direkte med omvendt-fase væskekromatografi og on-line massespektrometrisk sekventering (LC-MS/MS). I alt blev 426 proteiner, oversat fra databaser bestående af åbne læserammer og udtrykte cDNA sekvenser, identificeret.

  De formodede vakuolære proteiner blev kategoriseret i ni grupper (antal i parentes); lagringsproteiner (8), stress- og forsvars-relatede proteiner (102), proteiner relateret til signallering og nedbrydnings-processer (25), proteaser (5), membran-associerede proteiner (7), proteiner involveret i udvikling af knolden (3), cytoskeleton-relatede proteiner (6), proteiner med forskellige funktioner (78) og proteiner med ukendt funktion (56). I dette studie blev der foretaget en dybtgående analyse af kløvningssteder og terminale peptider for de største superfamilier af identifiecerede proteiner. En kombination af mulige vakuolære transportsignaler og en manuel inspektion af de oversatte EST sekvenser for de identificerede proteiner, gav ophav til fem grupper af formodede transportsignaler; tre typer af C-terminale signaler, sekvens-specifikke signaler og en blandet gruppe af potentielle transportsignaler, der er relateret til den fysiske struktur.

  De tre grupper af C-terminale transportsignaler, der blev fundet i dette studie, består generelt af alifatiske aminosyrerester (A, V og I) i et hydrofobt miljø. Den ene gruppe har mere end en alanin (overvejende tre) iblandt de sidste ti oversatte C-terminale aminosyrerester før stopcodon. Den anden gruppe med C-terminale transportsignaler har tre eller flere valiner iblandt de sidste ti C-terminale rester. Den tredje gruppe repræsenterer proteiner med aminosyresekvens-motivet [I]-[X_1,2]-[I] (hvor X kan være enhver rest) i C-terminalen. Hvorvidt de C-terminale transportsignaler bliver fjernet under den vakuolære import kræver yderligere undersøgelse. Gruppen af sekvens-specifikke transportsignaler kan opsummeres med motivet [N]-[P]-[I]-[NVD]-[L]-[P].

  Dette studie har vist, at den vakuolære transport af proteiner er meget kompleks, både med hensyn til forskellige typer af transportsignaler, men også indenfor hver type af transportsignaler, som vist med superfamilien af Kunitz proteaseinhibitorer. Resultaterne indikerer, at mange vakuolære proteiner måske bliver transporteret til vakuolen via mere komplekse mekanismer end specifikke aminosyre-sekvenser eller mønstre i fordelingen af aminosyrerester.