Association of outer membrane protein fragments

I disse år er vi ved at opbygge en strukturel viden om membranproteiner, som imidlertid ikke medfølges af en tilsvarende forståelse for de kræfter der stabiliserer proteinerne og hjælper dem med at folde. Dette hænger sammen med de vanskeligheder der er forbundet med at få membranproteiner til at folde ind i kunstige cellemembraner . Ikke desto mindre er forsøg vores bedste kilde til detaljeret viden herom. Af tekniske grunde er det i dette sammenhæng særligt udbytterigt at dele membranproteinet op i to dele og så måle hvor godt de binder til hinanden, da det er et udtryk for proteinets stabilitet. Vi vil derfor anvende denne fremgangsmåde for to model membranproteiner fra , hvis strukturer er grundlæggende forskelligt. (DsbB) består af 4 transmembrane   in vitro   in vitro     E. coli   Disulfide bond forming protein B a -helicer.   a -helicer er som regel stabile hver for sig, og ifølge To-trins modellen formodes sådanne a -helix proteiner at kunne indlejres i membranen ved at de enkelte helicer indføjes hver for sig (evt. som helix-par), hvorefter de finder sammen med hinanden og danner den native struktur. Det andet protein er (OmpA), som danner en   Outer membrane protein A b -tønde bestående af 8 b -strenge. Da hver   b -streng danner brint-bindinger med to andre strenge, formodes hverken de enkelte strenge eller eventuelle b -hårnåle at være stabile på egen hånd, og derfor forventes foldning at være en meget mere kooperativ proces. Ikke desto mindre har forsøg vist at både DsbB og OmpA kan danne aktive proteiner ved at udtrykke proteinet i to ca. lige store halvdele. Spørgsmålet er m.a.o. hvor foldningsprocessen er. Vi vil fremstille brudstykker af hver enkel protein, kløvet ved forskellige steder, og undersøge deres struktur hver for sig og i kompleks med gængse spektroskopiske teknikker (fluorescens, cirkulær dikroisme og NMR; adgangen til flere fragmenter hver for sig betyder at hvert fragment kan mærkes med en bestemt kemisk gruppe så man kan følge fragmenternes binding til hinanden). Desuden vil vi måle hvor stabile komplekserne er og hvor hurtigt de dannes for at kortlægge betydningen af den topologiske begrænsning der ligger i at fragmenterne er bundet sammen i det intakte protein. Vi vil i særdeleshed foikusere på hvilken rolle individuelle aminosyre-kontakter såvel som lipid-sammensætningen har for processen. Lipid-protein kontakter forventes at være særligt betydningsfulde for fragmentassociering, da der er færre topologiske begrænsninger og fragment-binding medfører frigivelse af lipid-molekyler.   in vivo   hierarkisk